珪藻のケイ化細胞壁のエキソサイトーシスには広範な膜崩壊が含まれる

Nature Communications volume 14、記事番号: 480 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

珪藻は、シリカ細胞壁を特徴とする単細胞藻類です。これらのシリカ要素は、膜に結合したシリカ沈着小胞内で細胞内に形成され、完成後にエキソサイトーシスされることが知られています。これらの大きくて硬いシリカ要素のエキソサイトーシス中に珪藻が膜の恒常性をどのように維持するかは不明のままです。今回我々は、生細胞共焦点顕微鏡、透過型電子顕微鏡、クライオ電子断層撮影法を用いて、2つのモデル珪藻種における細胞壁形成とエキソサイトーシス中の膜動態を研究する。我々の結果は、その形成中に鉱物相がシリカ堆積小胞膜と緊密に結合しており、繊細な幾何学模様の正確な型を形成していることを示しています。我々は、エキソサイトーシス中に、目立ったエンドサイトーシスの回収や細胞外再利用を行わずに、遠位シリカ沈着小胞膜と原形質膜が徐々にミネラルから剥離し、細胞外空間で崩壊することを発見しました。我々は、細胞内で、近位のシリカ沈着小胞膜が細胞とその環境の間の新たな障壁となり、新たな細胞膜の役割を担うことを実証した。これらの結果は、珪藻シリカエキソサイトーシスの直接的な構造観察を提供し、重要な膜パッチをリサイクルするのではなく廃棄することによって膜恒常性が維持されるという驚くべきメカニズムを指摘している。

珪藻は、複雑な種特有の形状と階層的な孔パターンを持つシリカ細胞壁を特徴とする単細胞藻類の多様なグループです1。種間の形態学的多様性は非常に大きいにもかかわらず、ほとんどの珪藻の細胞壁は、シャーレのように部分的に重なった 2 つの同様の形状のシリカ「殻」の保存されたレイアウトを持っています。各「シェル」自体は、バルブと一連のガードルバンドで構成されています。通常、弁は細胞の形状を決定し、豊かな装飾が施され、階層的な細孔パターンを含んでいます。ガードルバンドは、セルの側壁を囲む部分的に重なるリングを形成します。

珪藻の細胞壁の形成は生物学的制御下にあり、細胞周期に関連しています2、3、4、5。各娘細胞は親細胞壁の半分を受け継ぎ、細胞分裂直後に 2 番目の弁を形成します。新しいガードルバンドが形成され、細胞の成長中に新しい弁に取り付けられます（図S1）。ケイ化は通常、細胞内プロセスであり、膜結合細胞小器官であるシリカ沈着小胞（SDV）の内部で起こります6、7、8。 SDV は細胞膜の下に位置する薄くて細長い細胞小器官です。細胞は SDV 内の化学環境を調節し、その結果、ケイ化プロセスを厳密に制御し、その結果、非常に特異的で再現性の高い細胞壁構造が得られます 9、10、11、12、13。細胞内成熟後、シリカ要素はエキソサイトーシスされて細胞表面を覆います6、14。 SDVの内容物は細胞の完全性を損なうことなく分泌される必要がある巨大な固体構造であるため、このようなエキソサイトーシス現象は細胞生物学において例外的です。

古典的なエキソサイトーシス経路では、細胞内小胞の膜が原形質膜と融合して、その内容物を細胞外空間に送達します。原形質膜の恒常性は、分泌小胞が原形質膜と一体化するのを防ぐ一時的な融合によって、または代償性エンドサイトーシスによって追加された膜をオフセットすることによって維持できます15。しかし、珪藻の細胞壁の分泌は、その大きさと硬さにより、生物に大きな困難を与えます。新しいバルブは細胞の全表面の半分を覆い（図S1）、したがってSDV膜の表面積は細胞膜全体と同様になります。したがって、SDV 膜との融合により、細胞膜面積がほぼ瞬時に 2 倍になります。

以前の研究では、珪藻におけるシリカ細胞壁のエキソサイトーシスに関するいくつかの仮説が提唱されました14、16、17、18、19、20、21、22、23（図S2）が、重大な実験上の課題がさらなる進歩を妨げています。一方で、電子顕微鏡による超微細構造研究のための従来のサンプル前処理では、膜の収縮や構造の変形などのアーチファクトが発生します24。一方で、生きた細胞における細胞壁形成の動的な側面を研究する際の光学顕微鏡の利点は、空間分解能が低いことと、珪藻に対する分子生物学ツールが不足していることによって制限されています 25,26。これらの制限により、細胞内での SDV の現場観察はまばらであり、ケイ化およびエキソサイトーシスのプロセスの性質に関する直接的な証拠は欠けています。

この研究では、生細胞共焦点蛍光顕微鏡、透過型電子顕微鏡 (TEM)、およびクライオ電子断層撮影 (クライオ ET) を使用して、2 つのモデル珪藻種、Stephanopyxis turris および Thalassiosira pseudonana の弁形成およびエキソサイトーシス中の膜動態を調査しました。比較的大きな S. turris 細胞は容易に識別できるシリカ構造を持っており、蛍光顕微鏡を使用して個々の弁の詳細な観察とその構造的特徴の動的な発達を可能にします 27,28。さらに、cryo-ET を使用して、ネイティブのような条件で T. pseudonana の SDV の高解像度 3D データを取得します 29,30。我々の結果は、両方の種の弁エキソサイトーシスには、近位SDV膜の新しい細胞膜への再利用を伴う遠位膜の崩壊が関与していることを示しています。

私たちは、S. turris と T. pseudonana の 2 種を研究することにより、珪藻における弁エキソサイトーシスを調査しました (図 1)。 S. turris の弁はカプセル状で 2 層構造になっています。近位層は薄く、ナノサイズの細孔が穿孔されており、遠位側には大きな多角形を形成するより高い層が重なっています（図1a'、a"）。多角形層の上部は平らで、「」を形成しています。断面はT'字型（図1a''）。 S. turris 細胞は、弁の頂点から伸びるシリカの管状連結延長部を介して連結された鎖を形成します (図 1a、矢印)。 T. pseudonana 細胞は樽の形をしており、はるかに小さく、弁は直径約 5 μm の円盤です (図 1b)。小さな細孔が放射状リブの間の領域にわたるシリカ層に穴を開け、フルトポーチュラと呼ばれる大きな管状細孔が弁の縁を飾ります7（図1b'、b"）。図1eおよびfは、分裂中および直後の細胞を示しています。、弁の形成。新しく形成された弁は、生物学的石化のプロセス中にシリカに組み込まれる蛍光色素である PDMPO によって染色されます 31。細胞のサイズとエキソサイトーシスの直前の成熟した弁のサイズを比較すると、これらの硬い弁のエキソサイトーシスに伴う大きな課題がわかります。シリカ細胞壁（図1g、h）。

a、b 少なくとも 2 つのサンプルを表す SEM 画像。シリカバルブ構造の詳細は、サブパネルに高倍率で示されています。 c、d 連結延長部を介して接続された鎖内の2つのS. turris細胞と、細胞周期のさまざまな段階にあるいくつかのT. pseudonana細胞の明視野光学顕微鏡画像。 e、f 弁形成中の2つの異なるS. turris娘細胞、およびPDMPOで蛍光染色された新しい弁を備えた（d）と同じT. pseudonana細胞のPDMPO蛍光画像。 4 つの同期実験の結果を図 S3 に示します。 g、h 細胞内で形成された弁のエキソサイトーシスの直前の状況を示す S. turris および T. pseudonana の概略図。スケールバー: 10 μm (a、c、e)、5 μm (d、f)、1 μm (a'、a"'、b)、500 nm (a")、100 nm (b'、b")。

私たちは、生細胞の微速度撮影共焦点顕微鏡を使用して、S. turris の膜動態を研究しました（図 2）。同期培養物は、シリカ形成を追跡するために PDMPO で標識され（図 S3）、細胞膜を染色するために FM4-64 で標識されました。 FM4-64 は、細胞膜に組み込まれる両親媒性蛍光色素です 32。異なる珪藻に急速に内部移行するFM1-43などの同様の色素とは異なり、FM4-64は細胞膜のみを標識し、S. turris細胞に受動的に浸潤しません（図S4）。ケイ化中、PDMPO 信号と FM4-64 信号は、共焦点顕微鏡の解像度に至るまでほぼ共局在します (図 2a)。これは、原形質膜と SDV 内で成長するシリカ構造が非常に近接していること、つまり原形質膜が SDV の形状を裏打ちしていることを示しています。それにもかかわらず、連結伸長の成長先端は膜色素でのみ染色され、SDVの伸長がその最も辺縁部分のケイ化に先行することを示しています（図2a、矢印）。

a、b 蛍光チャネルのオーバーレイ画像。 a'、b' シングルチャンネル FM4-64 蛍光画像。 a-a' 弁形成中の娘細胞は FM4-64 と PDMPO の両方で標識されています。膜は成長する多角形の輪郭を描き、リンク拡張部 (矢印) の成長を導きます。 b 弁形成とエキソサイトーシスを経てFM4-64のみで標識された娘細胞のタイムラプスからのスナップショット。画像内には撮影開始からの経過時間が表示されます。 b' b のセルの単一のリンク拡張部分のトリミングおよび拡大図 (ボックスで示されている)。弁のエキソサイトーシスの開始は t = 132 から見られ、その後、連結延長部の周囲の膜残存物は細胞に接続されなくなり、徐々に崩壊します。スケールバー: 20 μm (a、a')、10 μm (b)、および 1 μm (b')。

弁形成とエキソサイトーシスの全プロセスを経るS. turris細胞の膜動態のタイムラプスを記録しました（図2b、ムービーS1）。ケイ化は細胞の頂点から始まり、放射状に進行します。弁形成の進行は、成長する多角形のシリカ層と連結延長部の輪郭を示す蛍光原形質膜によって視覚化されます（図2b、t = 0〜t = 126）。エキソサイトーシスの開始、すなわち原形質膜-SDV-シリカ複合体の緩みは、標識された原形質膜がもはや多角形の輪郭をはっきりと示していないことから明らかです（図2b、t = 132）。同時に、蛍光シグナルの増強が観察されます（図S5）。これはおそらく、SDV内腔を周囲の媒体に露出させる血漿とSDV膜の融合によるものであり、そこから遊離FM4-64が浸潤して染色することができます。細胞膜に加えて SDV 膜。それにもかかわらず、蛍光顕微鏡の解像度が限られているため、エキソサイトーシスの前後のSDVと細胞膜の間の相互作用を空間的に解決することはできません（図S6）。

S. turris の連結伸長は、エキソサイトーシス前は古い原形質膜がこれらの長い構造を囲んでいますが、エキソサイトーシス後は新しい原形質膜がその基部にのみ存在するため、エキソサイトーシスのプロセスを研究するユニークな機会を提供します。連結延長部分の周囲のFM4-64シグナルは成長中連続的ですが、延長部分がフルサイズに達すると、蛍光シグナルは中断されたパッチに変化し、徐々に消えます（図2b、t = 156およびt = 234）。これは、以前に報告された Coscinodiscus wailesii の膜蛍光研究と一致しています 33。場合によっては、連結延長部分を囲む膜が明らかに細胞体に接続されていないことがあります (図 2b')。染色された膜のパッチが細胞から切り離されるこの標識パターンは、染色された膜が細胞内で回収され再利用されるべき古典的なエキソサイトーシスプロセスの予想とは大きく異なります。 FM4-64 は実験全体を通じて培地中に存在しますが、脂質環境でのみ蛍光を発することに注意することが重要です 32。したがって、構造的に無傷な膜のみをラベルし、膜が崩壊すると、奇形の破片はラベルしなくなります。したがって、これらの観察は、分裂したばかりの娘細胞の間の細胞外空間で、遠位膜の主要部分が主細胞表面から完全に剥がれ、徐々に崩壊し、蛍光標識を失うというシナリオを示しています。

同じプロセスを超微細構造分解能で観察するために、TEM 分析用に分裂中の S. turris 細胞を準備しました。つまり、同期した細胞を高圧凍結によりガラス化し、その後凍結置換して樹脂に包埋しました。これにより、細胞内構造のネイティブに近い状態の保存と室温でのハイスループット TEM イメージングの機能の最適な組み合わせが実現します。この手順に従って調製されたS. turris細胞のTEM画像は、細胞環境、特にSDVの膜と無機内容物の例外的な保存を示しています（図S7）。

私たちは、細胞周期のさまざまな段階で 227 個の細胞から数百枚の画像を取得し、これらの画像を分類および分類することで、S. turris の弁形成とエキソサイトーシスのタイムラインを再構築しました (図 3)。成長中の弁を含む SDV を持つ細胞は、弁形成段階にあるものとして分類されました (n = 61、例は図 3a–b に示されています)。これらの段階では、3 つの脂質二重層、近位および遠位の SDV 膜も同様に存在します。遠位の SDV 膜は細胞膜に非常に近接しており、その距離はわずか 10 ～ 30 nm です (図 3a" 挿入図)。バルブ形成の初期段階では、SDV はシリカの堆積が進んだところまでしか広がりません (図 3a")。シリカの析出が放射状に進むにつれて、SDV も一緒に拡張します。多孔質のベース層の形成後、その上に多角形の層が形成されます。遠位側 (図 3b–b"、矢印)。ケイ化プロセス全体を通じて、SDV 膜は成長バルブの輪郭をしっかりと描き、シリカの形態が SDV 膜の制御下にある高度に限定された空間を形成します。弁はまだSDVに完全に囲まれている間に最終形態に達し、完全に成熟した弁を含む無傷のSDVを持つ23個の細胞を観察しました（図3c-c」）。

左の列は各ステージの代表的な画像を示し、右の列のボックス領域の高倍率ビューを示します。 a 弁の形成は細胞の頂点から始まります。 a' 細胞膜の直下に位置する SDV 内でシリカを成長させます。 a" SDV は、成長するシリカの端で終わります。挿入図は、近位 (紫色) と遠位 (ピンク) SDV の二重層と原形質膜 (黄色) を高倍率で示しています。 b 弁形成後の後半、b' 多角形の層(矢印) は基層の上に形成され、b" 新しい弁の成長端は親弁の縁に達します。 c 新しいバルブの珪化は、SDV 内に完全に密閉された状態で完了します。成熟した弁は、c' 完全に形成され平らになった多角形の層、および c" 弁の縁にある顕著なフック形状 (矢印) によって識別できます。 d エキソサイトーシスの開始時、d' 膜はまだ新しい弁の大部分を取り囲んでいます。、d」ですが、それらは完全な囲い（矢印）を形成しなくなりました。 e エキソサイトーシスの直後、e' 遠位膜は構造的完全性を失い (矢印)、e" 細胞膜は新しい弁の下で連続しています (矢印)。 f–f" エキソサイトーシスの完了後 (n = 75)、遠位膜残存物の痕跡は残っていません。画像の右側の表は、各発生段階で観察された細胞の数と膜陥入が存在した場合の数をまとめたものです（詳細は図S8と本文を参照）。スケールバーは 5 μm (a ～ f)、1 μm (d'、e'、f')、500 nm (a'、c'、c"、d"、e"、f")、200 nm (a "、b'、b"、c' 挿入図) および 50 nm (a" 挿入図)。

68 個の細胞の画像では、いくつかの不連続な SDV 膜に囲まれた成熟した弁が観察されました。つまり、SDV は完全な囲いを形成していません。この構造情報に基づいて、これらの細胞がエキソサイトーシスを受けていると定義します。これらの膜の不連続性は非常に局所的である可能性がありますが、弁の大部分はまだ SDV によってしっかりと囲まれています (図 3d–d")。後の段階では、膜の超微細構造が劇的に変化します。遠位 SDV と血漿の厳密な描写弁周囲の膜が緩み、遠位膜の構造的完全性の劣化が観察されます (図 3e-e")。弁の近位側の膜は、親弁の下の細胞膜と連続しています（図3eの矢印）。エキソサイトーシスプロセスの終わりには、親ガードルの下に位置するため、新しい弁を認識できます。バンドは見られますが、細胞質の外側には目に見える膜の痕跡は見られません（n = 75、図3f–f」）。

SDV膜のリサイクルに関連する可能性のあるエンドサイトーシスによる膜回復の兆候を特定するために、新しく形成された弁の近位の膜の顕微鏡データを分析しました。我々は、エキソサイトーシス段階の細胞における膜陥入を7回観察した。これらの陥入のサイズは0.5から3μmまで変化します（図S8）。しかし、このような陥入は、同様の発生で弁形成およびエキソサイトーシスのすべての段階で検出され（Χ2 (df = 2、N = 152) = 2.23、p = 0.327）、したがって、エキソサイトーシス後の膜のリサイクルと相関させることはできません。全体として、TEM データは生細胞イメージングと一致しており、弁エキソサイトーシス中に遠位膜は回復の兆候なしに細胞外に崩壊する一方、新しい弁の近位で唯一目に見える膜は近位 SDV 膜であることを示唆しています。

細胞組織をネイティブ状態にできるだけ近づけて視覚化するために、弁エキソサイトーシスを受けている T. pseudonana 細胞からクライオ電子断層撮影 (cryo-ET) データを取得しました。これらのセルはサイズが小さいため、クライオ ET によるイメージングに必要なサンプル前処理ステップに適しています。つまり、プランジ凍結を使用して同期化した T. pseudonana 細胞をガラス化し、集束イオンビームを使用して薄いラメラを調製し、極低温条件下で電子断層像を収集しました 30,34。画像化された59対の娘細胞のうち、15対は弁エキソサイトーシス中または弁エキソサイトーシス直後、すなわち最初のセットのガードルバンドのエキソサイトーシス前にあった。そのうちの4つはエキソサイトーシスの初期段階にあり、新しい弁は部分的にのみSDV膜で覆われていました（図4a〜d）。

a、c、e 再構成された 3D ボリュームをスライスします。強調表示された長方形内の一部のフィーチャは、b のカラーコードに従って人工的に色付けされています (pSDV メンブレン - 近位 SDV メンブレン、dSDV メンブレン - 遠位 SDV メンブレン)。 b、d セグメント化されたボリュームの 3 次元サーフェスレンダリング。 f 提案された珪藻の弁エキソサイトーシス機構を示す概略図。 a と c は、f に示されている同じ娘セル上の異なる位置を示しています。スケールバー: 100 nm、スライス厚 1.15 ～ 5.7 nm。ムービー S2、3 も参照してください。

図4a、cは、わずかに同期していない同じペアの娘細胞の異なる位置の断層像を示しています。左はエキソサイトーシス直前、右はエキソサイトーシス中です。左側の弁は依然として SDV 内に完全に囲まれていますが、右側の弁は遠位膜による被覆の不連続性を通じてすでに細胞外空間に露出しています。どちらの細胞でも、3 つの脂質二重層が確認できます。エキソサイトーシス前の娘細胞では、予想される膜の配置が見られます。原形質膜が細胞全体を覆い、SDV膜のすぐ下で弁を完全に取り囲んでいます（図4a、b、左側）。しかし、エキソサイトーシス中に、遠位膜は複数の部位で融合し、平膜嚢のネットワークを形成し、弁の近位側の膜が細胞の最も外側の境界になります（図4a、b、右側）。同様の状況が弁周囲でも観察され、フルトポルチュラの遠位側に接続されていない膜状構造が見られます（図4c、d、右側）。

エキソサイトーシスの後期段階にある8対の細胞において、2つの娘細胞の最近エキソサイトーシスされた弁とそのガードルバンドの間に位置する大きな膜性小胞を観察しました（図4e）。最近エキソサイトーシスされた弁を有する残りの 3 対の細胞では、2 つの娘細胞の間に小胞や膜の残骸は観察されませんでした。しかし、これら 3 つの細胞では、親のガードルバンドが娘細胞を取り囲んでいませんでした。これは、すべての細胞外残骸が分解された細胞周期の後期段階を示しています。注目すべきことに、画像化された細胞には、出芽中のエンドサイトーシス小胞や弁の下に新しい膜が形成される兆候は含まれていませんでした。したがって、クライオETデータは、T. pseudonanaが、S. turrisで収集されたデータから推測したのと同じエキソサイトーシス機構を使用していることを示唆しています。この機構では、近位SDV膜が新しい細胞膜として再利用され、遠位膜が細胞外で崩壊します（図1）。 4f）。

珪藻の硬い細胞壁の押し出しは例外的なエキソサイトーシス現象であり、既知のエキソサイトーシス機構と一致させるのは困難です。 3つの顕微鏡技術を用いて得られた2種類の珪藻の細胞外空間における剥離した膜パッチの我々の観察は、古典的なエキソサイトーシス機構と両立しない。バルブ形成後のこれらの接続されていない緩い膜の構造特性は、成長するシリカ構造の形状を制御する上で極めて重要な高度に限定された空間を形成するシリカ成長中の SDV 超構造とは顕著に対照的です 35,36,37。したがって、成熟弁のエキソサイトーシスは、古い細胞膜と遠位SDV膜が細胞外空間に廃棄され、近位SDV膜が新しい細胞膜の役割を果たすという独特のメカニズムを介して発生することを示唆しています（図4f、S2）。。このシナリオは、T. pseudonana の生細胞研究における SDV タンパク質と細胞膜との急速な交換に関する以前の観察と一致しています 2,38。

このシナリオは、データセット内のどの細胞にも SDV 膜の処理やリサイクル、あるいは弁の下での新しい細胞膜の形成の兆候が見られないという事実によっても裏付けられます。それにもかかわらず、生細胞イメージングにはそのような現象を検出するための空間分解能がない可能性があり、電子顕微鏡法では時間と空間のランダムなスナップショットに関する情報しか得られないことを私たちは認識しています。これらの理由から、我々は統計分析を実施して、エキソサイトーシスが SDV 膜のエンドサイトーシスのリサイクルに実際に関与している確率を決定しました。テストされたシナリオは、S. turrisで観察された〜1μmの陥入が実際にはそのようなエンドサイトーシスの回復プロセスの一部であるということでした（図S8）。この場合、約 1,300 個の陥入物をリサイクルする必要があります。陥入が発達して画像に表示されるまでの時間枠を 10 ～ 20 秒、弁エキソサイトーシスには合計 30 分を想定して、統計シミュレーションを実行しました (サポート情報セクションを参照)。このシミュレーションでは、ランダムな TEM の薄いスライスでこのイベントを「キャッチ」する確率も検討します。陥入の許容条件を 10 秒として使用してシミュレーションを 10,000 回実行すると、そのような陥入は 68 回の観察のうち平均 15 回検出されるはずであることが示されました (68 回の実際の観察に対応、図 3)。さらに、ケースの99.9％以上で、シミュレートされたシナリオには、68回の観察が行われたときに7回以上のそのようなイベントの検出が含まれていました（7回の観察ケースに対応、図S8）。したがって、順列検定によれば、代償性エンドサイトーシスによるこれらの膜の内部移行の選択肢を p < 0.001 の確率で除外できます。

提案されたシナリオは、エキソサイトーシスの際、近位 SDV 膜が新しい細胞膜になることを示唆しています。 SDV 膜と細胞膜はそれぞれ特殊な異なるタスクを実行するため、おそらく両方とも独自の脂質とタンパク質の組成を必要とし、融合後に調整する必要があると考えられます。実際、SDV を含む T. pseudonana 細胞は、SDV を含まない細胞と比較して脂質組成がわずかに変化していることが示されており、いくつかのタンパク質が SDV 膜と特異的に結合していることが示されています 2,39,40,41。原形質膜特異的脂質組成を回復するための近位 SDV 膜の変化の可能性は、ドナー膜とアクセプター膜の間で特定の脂質を輸送する脂質キャリアである、いわゆる脂質輸送タンパク質によって媒介される可能性があります 42。細胞周期ごとにこのような大量の膜を廃棄するのは無駄であると思われるため、遠位膜が細胞外で崩壊するという発見は驚くべきである。分解する破片に対する FM4-64 の親和性が低いため、これらの膜の運命に従う能力が妨げられます 32。それにもかかわらず、ガードルバンドは新しく形成された弁の周りに準密閉された区画を形成し、おそらく細胞からの拡散を遅らせ、崩壊後の細胞利用のための膜破片の取り込みを促進することに留意することが重要である。これにより、そのようなプロセスのエネルギーコストを最小限に抑えることができると考えられます。

大きな内容物のエキソサイトーシスは他の生物でも研究されており、膜と融合する多数の小さな小胞の古典的な分泌経路とは異なるメカニズムが実証されています43。別の方法の 1 つは、ショウジョウバエの唾液腺における巨大小胞のエキソサイトーシスです。これは、小胞膜を押しつぶすことによって粘性の積荷を細孔を通して絞り出し、続いて膜をリサイクルします 44。もう一つの選択肢である先体反応は、驚くべきことに、珪藻の弁エキソサイトーシスに関する我々の提案と類似点を共有しています。このプロセスでは、原形質膜と遠位先体膜がいくつかの場所で融合して小胞が形成され、環境中に分散しますが、近位先体膜は無傷のままで、精子を環境から隔てる新しい境界となります45,46。

結論として、この研究は、2 つの注目すべき出来事を含む、珪藻シリカのエキソサイトーシスのユニークなメカニズムを提案しています。 1 つ目は細胞小器官の膜を細胞膜に再利用すること、2 つ目は膜の大規模な崩壊です。このメカニズムは 2 つのモデル珪藻種に共通しており、これが一般的なメカニズムである可能性があることを示しています。珪藻の遺伝研究のためのツールボックスが成長していることにより、このイベントの制御に関与するタンパク質機構と古典的なエキソサイトーシスとの関係を調査することが間もなく可能になるでしょう。

S. turris は 2004 年に北海から分離され、ドレスデン工科大学の Eike Brunner 教授のグループによって提供されました。珪藻培養物は、ろ過され、塩分濃度が 3.5% に補正され、f/2 の栄養素レシピ (Sigma Aldrich) が補充された天然の地中海海水で維持されました。また、Thalassiora pseudonana (CCMP1335) の場合は 330 μM ケイ酸 (Sigma Aldrich) が補充されました。培養物は、16/8 時間の明暗サイクル下、18 °C で維持されました。

細胞周期を同期させるために、5 ml の成熟 S. turris 細胞培養物を使用して、新しい 50 ml 培養を開始しました。通常の 16 L/8 D サイクルで 48 時間増殖させた後、培養物を暗所に 20 時間置きました。 20 時間の暗闇の後、培養物を再び光にさらしました。 T. pseudonana の同期は、前述したように Si 欠乏を使用して行われました 7。培養物を対数増殖期に維持するために、それらを12/12時間の明/暗サイクル下で増殖させ、培養を同期させる前の週の間、一日おきに新鮮な培地に希釈(1:10)した。 Si 欠乏を誘発するために、培養液の 100 ml アリコートを 3000 × g で 10 分間遠心分離し、Si を含まない人工海水または濾過海水に再懸濁しました。このステップを 3 回繰り返しました。次いで、培養物（約５０万細胞／ｍｌ）を、細胞周期を停止させるために、Ｓｉを含まない培地中で撹拌しながら暗所で１２時間維持した。次に、培養物を連続光に移し、さらに 4 時間 Si 欠乏状態にしました。 Si 飢餓期間の終わりに、細胞は約 1,000 万細胞/ml まで濃縮され、Si は 330 μM まで補充されました。新しいシリカの形成を追跡するために、PDMPO [2-(4-ピリジル)-5-((4-(2-ジメチルアミノエチル-アミノ-カルバモイル)メトキシ)-フェニル) オキサゾール] (ThermoFisher Scientific、米国) を追加しました。 PDMPO蛍光は、落射蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse Ni-U、ex: 365 em: 525)で培養物を画像化することによってモニタリングした。最も多くの分裂している S. turris 細胞と T. pseudonana 細胞をそれぞれ 9 時間後と 3 時間後に計数しました。

細胞は、臨界点乾燥 (CPD) を使用して SEM 用に準備されました。細胞を、人工海水中の2%グルタルアルデヒドおよび4%パラホルムアルデヒドの溶液中で振盪しながら室温で1時間固定した。脱イオン水 (Milli-Q® IQ 7003 Ultrapure Lab Water System、Merck) で 3 回洗浄した後、段階的な一連のエタノールで洗浄することにより細胞を脱水しました。最後の洗浄は、100％無水エタノール中で一晩行った。次に、脱水したサンプルを、液体 CO2 を遷移流体として使用する臨界点乾燥機で乾燥させました。乾燥した細胞を、アルミニウムのスタブ上の導電性カーボンテープの上に置きました。

サンプルを 2.5 nm (T. pseudonana) または 4 nm (S. turris) イリジウム (Safematic) でスパッタコーティングし、Ultra 55 FEG 走査型電子顕微鏡 (Zeiss、ドイツ) で 3 ～ 5 kV、開口サイズ 20 を使用して画像化しました。 –30μm、作動距離約3mm。

単一細胞タイムラプスイメージングの場合、培養物を同期させて PDMPO (330 μM) で染色しました。光飢餓終了から約 8 時間後、ほとんどの細胞が細胞質分裂を行った時点で 100 μl を採取し、FM4-64 (ThermoFisher Scientific、米国) を最終濃度 4 ～ 8 μM で添加して膜を染色しました。。膜色素を添加した後、20 μl の液滴を顕微鏡スライド上に置き、歯科用ワックスをスペーサーとして使用してカバーガラスで覆いました。サンプルは、HCS PL APO 86×/1.20 W motCORR 対物レンズを備えた Leica TCS SP8-STED 共焦点顕微鏡を使用して視覚化されました。 FM4-64 およびクロロフィルの自家蛍光は、それぞれ 550 nm レーザーライン (6% レーザーパワー) および 650 nm レーザーライン (7% レーザーパワー) を使用した白色光レーザーによって取得されました。 PDMPO 蛍光は 405 nm レーザー (5% レーザー出力) を使用して取得されました。 PDMPO と FM4-64 には HyD-SMD 検出器が使用され、発光収集幅はそれぞれ 474 ～ 530 nm と 608 ～ 640 nm に設定されました。クロロフィルの自家蛍光発光は、検出幅 741 ～ 779 nm の HyD 検出器を使用して収集され、透過チャネルは PMT 検出器で検出されました。細胞は 3 ～ 60 分の間隔で 2 ～ 4 時間画像化されました。画像は Leica Application Suite X v3.5.7 を使用して分析されました。合計で、全期間にわたって 50 以上の細胞からタイムラプスが収集されました。

以前に公開されたプロトコールに従って、S. turris 細胞を高圧凍結 (HPF) を使用して凍結固定し、その後凍結置換 (FS) を行いました 29,47。同期した細胞を 5 µm フィルター膜上に収集し、200 µl の海水を使用してエッペンドルフチューブに移しました。細胞を10分間沈降させた後、2μlのアリコートをピペットでアルミニウムディスク（Wohlwend GmbH、ゼンヴァルト、スイス）に移し、Leica ICE高圧冷凍機（Leica Microsystems GmbH、Wetzlar、ドイツ）に直接ロードしました。濃縮された珪藻サンプルは、液体窒素 (-192 °C) 中で 210 MPa (2048 bar) でガラス化されました。ガラス化サンプルは、EM ASF2 (Leica Microsystems GmbH、Wetzlar、ドイツ) で凍結置換するまで液体窒素中で保管されました。 (-90 °C) で、ガラス化水を有機溶媒である 100% 無水アセトンに置き換えました。次に、細胞構造の架橋とコントラストを強化するために、アセトンに化学固定剤 (0.2% 酢酸ウラニルおよび 0.2% 四酸化オスミウム) を追加しました。サンプルを-90 °Cの溶液に48時間浸漬し、その後24時間かけて-20 °Cまで徐々に温め、その後1時間で0 °Cまで温めました。アセトン中で３回洗浄した後、勾配濃度混合物（アセトン中１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、８０％、１００％のＥｐｏｎ）を使用して、アセトンをＥｐｏｎ（ＡｇａｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＬｔｄ、スタンステッド、英国）と置き換えた。、室温で1日2回。 100% Epon のサンプルは 70 °C で 72 時間硬化されました。ダイヤモンドナイフ (Ultra 45°、Diatome Ltd、スイス、ニダウ) を備えたウルトラミクロトーム (Ultracut UCT、Leica Microsystems GmbH、Wetzlar、ドイツ) を使用して、70 nm の超薄切片をスライスしました。切片は、炭素膜でコーティングされた銅製の TEM グリッド上にピックアップされました。次いで、切片をクエン酸鉛溶液の一滴の上に置くことによって後染色した。 3 分間の染色後、グリッドを水滴で 3 回洗浄し、ワットマン濾紙に吸い取って乾燥させました。合計 16 個の凍結サンプルを準備し、3 つの異なるサイクルで凍結置換を使用してさらに処理し、その後数百の細胞を画像化しました。

TEM サンプルは、120 kV で動作し、Gatan Oneview 4 k × 4 k カメラ (Gatan Inc.、プレザントン、米国) を備えた Tecnai Spirit TEM (FEI、オランダ、アイントホーフェン) で画像化されました。

同期したT. pseudonana細胞を、グロー放電200メッシュ銅R2/1穴あきカーボンフィルムグリッド(Quantifoil Micro Tools GmbH、Grossloebichau、ドイツ)上でプランジ凍結することによってガラス化した。 Leica EM GP (Leica Microsystems GmbH、Wetzlar、ドイツ) では、吸取紙への培地の流れを促進するために、1 μl の人工海水が銅側にピペットで移され、4 μl の 7 ～ 13 × 106 細胞/細胞懸濁液が加えられました。 mlをカーボン側でピペットで移した。グリッドは、液体窒素で冷却された液体エタン浴に浸漬される前に、グリッドの裏側から６秒間ブロッティングされた。

ガラス化細胞は、Zeiss Crossbeam 550 FIB/SEM デュアルビーム顕微鏡 (Zeiss、ドイツ) を使用して薄いラメラに粉砕されました。グリッドは、その場ガス注入システムによって有機金属プラチナでコーティングされました。ラメラは、30 kV、300 pA および 100 pA の電流でガリウムイオンビームを使用する 2 つのステップを含む粗ミリング (厚さ 1 μm まで) により、グリッド面に対して 12° の傾斜でミリングされました。すべてのラメラを粗くミリングした後、50 pA の電流で 200 nm まで薄くしました。

クライオ電子断層撮影データは、59 対の細胞から収集されました。傾斜シリーズは、300 kV で動作する Titan Krios G3i TEM (Thermo-Fisher Scientific、アイントホーフェン、オランダ) を使用して取得されました。傾斜シリーズは、20 eV のスリットを使用して、BioQuantum エネルギーフィルター (Gatan Inc.、プレザントン、米国) の後ろに設置された K3 直接検出器 (Gatan Inc.、プレザントン、米国) で記録されました。すべての傾斜シリーズは、-12°のラメラプレチルトから開始して 2°ずつ増加する線量対称スキームを使用して、0.26 nm の物理ピクセルサイズに対応する 33,000 倍の公称倍率で計数モードで記録されました 48。図4a、cに示されている傾斜シリーズは、挿入されたVolta Phase Plateを使用して3μmデフォーカスで撮影されました。一連の傾斜範囲は -60° ～ 50° でした。図4eに示されている傾斜シリーズは、7μmのデフォーカス、100μmの対物レンズ開口部の挿入、および-66°から48°の傾斜範囲で撮影されました。傾斜シリーズは、SerialEM v3.8 に実装された自動低線量手順を使用して取得され、合計線量は ~100e-/Å2 49 に設定されました。断層像は、IMOD ソフトウェア v. 4.9.1250 を使用して再構成されました。セグメンテーションには Amira ソフトウェア v2021.2 を使用しました (Thermo-Fisher Scientific、アイントホーフェン、オランダ)。膜は、膜強化フィルターモジュールと手動による精製を使用してセグメント化されました51。

私たちのデータは、珪藻が驚くべき非標準的なメカニズムを使用してシリカバルブをエキソサイトーシスすることを示しています。珪藻が弁エキソサイトーシスの既知の標準的なメカニズムを使用する別のシナリオを検討するために、そのようなシナリオがありそうかどうかを知らせる統計的シミュレーションを実行しました。標準的なエキソサイトーシスでは、分泌小胞の膜が細胞膜と完全に融合し、代償性エンドサイトーシスによって追加された膜のバランスをとることで膜恒常性が維持されます。私たちが調査したいと考えている推定シナリオでは、SDV 膜は一定サイズの小胞の代償性エンドサイトーシスによってリサイクルされます。このようなシナリオをシミュレートするには、弁エキソサイトーシスの際に SDV 膜を再内在化するためにエンドサイトーシスされる必要がある小胞の数と、そのような小胞がデータセットに現れるはずの数を推定する必要がありました。

珪藻細胞の基本的な幾何学的特性から、近位および遠位の両方のSDV膜の表面積（連結延長部の周囲の膜を除く）≈ カプセルに単純化できる細胞全体の表面積（図S9）。したがって、そのようなカプセルの面積を計算しました。

カプセルは、両端に半球が付いた円柱です。カプセルの表面積は、中心の円柱の表面積と 2 つの半球の表面積を合わせた合計として定義されます。カプセルの表面積を計算するには、半球の半径 (r) と中央の円柱の長さ (a) が必要です。 S. turris 細胞の直径は 20 ～ 25 μm であるため、計算では半径 11 μm を選択しました。円柱の長さ (a) は、細胞の全長から 2 つの半球の半径を引いたものに等しくなります (60 μm – 11 μm – 11 μm = 38 μm)。したがって、カプセル (および SDV 膜) の表面積 (SA) は次のようになります。

S. turris の TEM データでは、直径 0.5 ～ 1 μm の範囲の膜陥入が観察されました。このような陥入の表面積は、その形状を球の形状に近似することで計算できます: \({{{{{{\rm{SA}}}}}}_{{{{{\rm{sphere} }}}}}}=4\pi {r}^{2}\)

前述の計算に基づくと、SDV 膜全体をリサイクルするのに必要なエンドサイトーシス小胞の数は次のようになります。

時間分解エンドサイトーシスの研究では、直径 1 μm の小胞の 1 回のエンドサイトーシスイベントには少なくとも 10 秒かかることが示されています 49,50,51,52,53,54,55。

データに基づくと、リサイクルプロセスは 30 分で完了するはずだと推測されます。

エンドサイトーシス小胞が観察される機会に影響を与えるセクション 4 と 5 の時間的要因に加えて、ランダムな TEM スライスでそのような小胞が検出される可能性である空間的要因もあります。細胞はカプセル状で、埋め込まれたサンプル内でほぼ水平に横たわっているため、直径 y の細胞の円形断面を通過するランダムなスライスで直径 x の小胞が検出される空間的確率を次のように推定できます (図 S9)。 ): \(\tfrac{x}{y}\) = \(\tfrac{1}{22}\) 22 μm の S. turris 細胞の TEM 切片内の 1 μm の小胞の場合。

前のセクションで特定した 4 つのパラメーターを考慮して、30 分の時間枠内で 10 秒間続く 1,274 個のイベント (エンドサイトーシス小胞) が存在するシミュレーションシナリオを構築します (R、v. 4.1.2 を使用)。イベントを視覚化する確率 (実際に発生している場合) が 0.045 (1/22) であるランダムなスナップショット (TEM スライス) を選択します。私たちの TEM データセットには、エキソサイトーシスを受けている 68 個の S. turris 細胞内の 7 つの考えられるエンドサイトーシス小胞が含まれているため、68 回の観察が行われた場合に、そのようなイベント 7 個が観察される確率はどのくらいかをシミュレーションしました。シミュレーションは、99.5%を超えるケースで7つを超えるエンドサイトーシスイベントが検出されるはずであることを示しています(図S10A)。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の主要な結果を裏付けるすべての関連データは、論文およびその補足情報ファイル内で、または合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。ソースデータは、この論文および Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.gxd2547n3) で提供されています。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

この調査で使用されたコードは、次のリンクから入手できます: https://zenodo.org/record/7339127#.Y58SgXZBwuU。

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文化を提供してくださったドレスデン工科大学の Anne Jantchke 氏、Nathalie Pytlik 氏、Eike Brunner 氏に感謝します。適切な生細胞イメージングプラットフォームの発見に貢献した火山研究所 (ARO) の Simon Michaeli に感謝します。このプロジェクトは、欧州連合の Horizon 2020 研究およびイノベーションプログラム (助成契約番号 848339) に基づいて欧州研究評議会 (ERC) から資金提供を受けています。生細胞イメージングは、ヴォルフガングとルース・レッサーを追悼するデ・ピッチョットがん細胞観察所で実施されました。この研究は、ワイツマン科学研究所 D.dH のアービングおよびチェルナ・モスコウィッツナノおよびバイオナノイメージングセンターによって支援されました。この研究はワイツマン科学研究所の持続可能性とエネルギー研究イニシアチブ (SAERI) によって支援されました。

ワイツマン科学研究所、植物環境科学部、レホヴォト、イスラエル

ハーン、リオール・アラム、ハダス・ペレド・ゼハヴィ、オズ・ベン・ジョセフ、アサフ・ガルの死

生命科学中核施設、ワイツマン科学研究所、レホヴォト、イスラエル

ヨセフ・アダディ & ロン・ロトコップフ

ワイツマン科学研究所、化学研究支援部門、レホヴォト、イスラエル

ナダフ・エラド & カティア・レチャフ

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D.dH.は、実験を実施し、データを分析し、原稿を起草し、編集しました。 LAはcryoET実験とデータ分析を実施した。 HPZ は共焦点顕微鏡実験を実施しました。 YA は、共焦点顕微鏡実験の実験計画に貢献しました。 OB は室温での TEM サンプルの準備を支援しました。 RR は統計分析を実施しました。 NE は、cryoET 実験とデータ分析に貢献しました。 KR は FIB ラメラの準備を支援しました。 AG は監督、資金調達、草案の修正を行いました。

アサフ・ガルへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Kimberlee Tamatrakoln と他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

デ・ハーン、D.、アラム、L.、ペレド・ゼハヴィ、H. 他。珪藻のケイ化細胞壁のエキソサイトーシスには、広範な膜崩壊が含まれます。 Nat Commun 14, 480 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36112-z

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受信日: 2021 年 8 月 4 日

受理日: 2023 年 1 月 16 日

公開日: 2023 年 1 月 30 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36112-z

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